Oksidativni stres

Za razumijevanje nastanka oksidativnog stresa važno je imati na umu kako je kisik neophodan za ljudski život i život svih aerobnih organizama. Potpuna oksidacija hranjivih tvari kao biološki izvor energije jedan je od najvažnijih preduvjeta formiranja viših životnih oblika. U kontekstu tih standardnih metaboličkih procesa aerobnih organizama kontinuirano se stvaraju radikali kisika i oni nisu primarno štetni. Štoviše, postoji čitav niz važnih staničnih procesa u kojima slobodni radikali imaju važnu fiziološku funkciju:

• Slobodni radikali su uključeni u sintezu nekih hormona.
• Leukociti i makrofagi koriste reaktivne kisikove molekule kao bi uništili strana tijela kao što su bakterije i virusi.
• Reaktivne kisikove molekule imaju važnu ulogu u molekulskoj signalizaciji i modulaciji staničnih procesa, između ostalog i u prirodnoj obrani od razvoja malignih tumora
• Sudjeluju u regulaciji transkripcije itd.

Stoga se može zaključiti kako su kisikovi radikali u ograničenim koncentracijama sastavni dio normalnog metabolizma.

Zdrave stanice nastoje uspostaviti i kontinuirano održavati ravnotežu između stvaranja i eliminacije kisikovih radikala. Ovu homeostazu stanica postiže produkcijom takozvanih antioksidansa, koji djeluju kao sakupljači radikala i tako neutraliziraju nastale reducirajuće i oksidirajuće molekule. Ako iz nekog razloga dođe do relativnog ili apsolutnog manjka antioksidansa, smanjuje se sposobnost stanica da uklanjaju reaktivne kisikove molekule. To onemogućuje adekvatan oporavak staničnih enzima i direktno utječe na smanjenje detoksikacijske funkcije stanice te dolazi do preplavljivanja stanica reaktivnim kisikovim molekulama. Drugim riječima, poremećaj ove homeostaze, odnosno promjena ravnoteže između oksidanata i antioksidanata u korist oksidanata naziva se “oksidativni stres”.

Radikali su visoko reaktivne molekule i u suvišku vrlo lako mogu oštetiti stanične strukture (staničnu membranu i organele), odnosno njihove komponente ugljikohidrate, lipide, proteine i DNA.

Nepopravljena, ova oštećenja mogu dovesti do smrti stanice. Ako i ne nastupi smrt stanice, oštećenja su često takva da olakšavaju nastanak brojnih bolesti, na primjer dijabetesa, kardiovaskularnih i neurodegenerativnih bolesti, amiotrofične lateralne skleroze, kroničnih upalnih bolesti, amiloidoze, autoimunih procesa te različitih malignih oboljenja. Najnovije studije ukazuju i na važnu ulogu oksidativnog stresa u patogenezi migrene, ali i brojnih drugih bolesti i stanja.

Endogeni izvori reaktivnih kisikovih molekula

Reaktivne kisikove molekule nastaju iz molekularnog kisika kao rezultat normalnog staničnog metabolizma. Molekule koje sadrže jedan ili više nesparenih elektrona i tako daju reaktivnost molekuli nazivaju se slobodni radikali. Kada 2 slobodna radikala dijele svoje nesparene elektrone, govorimo o neradikalnim oblicima reaktivnih kisikovih molekula, npr. H₂O₂.

Glavne fiziološke reaktivne kisikove molekule u organizmu su superoksidni anion (O₂^–), hidroksilni radikal (·OH) i vodikov peroksid (H₂O₂).

Superoksidni anion je primarni kisikov radikal koji nastaje iz različitih izvora dodavanjem 1 elektrona molekulskom kisiku. Ovaj proces je posredovan nikotin adenin dinukleotid fosfat (NADPH) oksidazom ili ksantin oksidazom ili mitohondrijskim sustavom za prijenos elektrona.

Glavno mjesto proizvodnje superoksidnog aniona je mitohondrij, tzv. stanična tvornica energije. Elektroni se u mitohondrijima standardno prenose kroz mitohondrijski prijenosni lanac elektrona za redukciju kisika u vodu, međutim otprilike 1 do 3% svih elektrona sustav propušta za proizvodnju superoksida.

NADPH oksidaza se nalazi se u polimorfonuklearnim leukocitima, monocitima i makrofagima. Nakon fagocitoze, pomoću NADPH oksidaze ove stanice proizvode salve superoksida koji onda djeluje izrazito baktericidno na sve fagocitirane uzročnike.

Djelovanjem superoksid dismutaza superoksid se pretvara u vodikov peroksid (H₂O₂) koji je šire raspoloživ s obzirom da lako difundira kroz plazmatsku membranu. Osim toga vodikov peroksid nastaje i djelovanjem ksantin oksidaze, aminokiselinske oksidaze i NADPH oksidaze. U prisustvu metalnih iona H₂O₂ oslobađa hidroksilne radikale. I sam superoksidni anion u reakciji s H₂O₂ generirat će hidroksilni radikal. Hidroksilni radikal je najreaktivniji o d svih reaktivnih kisikovih molekula i može oštetiti proteine, lipide, ugljikohidrate i DNA. Također može započeti peroksidaciju lipida oduzimanjem elektrona iz polinezasićenih masnih kiselina.

Granulocitni enzimi eozinofilna peroksidaza u eozinofilima i posebice mijeloperoksidaza (MPO) u neutrofilima dodatno proširuju reaktivnost H₂O₂. Pa tako npr. u aktiviranim neutrofilima MPO u prisutnosti kloridnog iona pretvara H₂0₂ u hipokloričnu kiselinu (HOCl) koja je također vrlo oksidativna i igra važnu ulogu u ubijanju patogena. Međutim, HOCl može reagirati i s DNA i potaknuti interakcije DNA-proteina, stvar ati pirimidinske oksidacijske produkte i dodati klorid u DNK bazu. Prema tome, eozinofilna peroksidaza i mijeloperoksidaza također doprinose oksidativnom stresu modificiranjem proteina halogenacijama, nitriranjem i unakrsnim vezama proteina putem tirozilnih radikala.

Od ostalih endogenih kisikovih radikala valja još izdvojiti peroksilne radikale (ROO ·), od kojih je najjednostavniji hidroperoksilni radikal (HOO ·) i koji ima važnu ulogu u peroksidaciji masnih kiselina. Peroksidacija lipida nastaje apstrahiranjem atoma vodika iz metilenskog ugljika u bočnom lancu, nakon čega lipidni radikal reagira s kisikom kako bi se dobio peroksilni radikal. Peroksilni radikal inicira lančanu reakciju i transformira polinezasićene masne kiseline u lipidne hidroperokside. Lipidni hidroperoksidi su vrlo nestabilni i lako se razgrađuju na sekundarne produkte, kao što su aldehidi i malondialdehidi (MDA). Peroksidacija lipida remeti integritet staničnih membrana i utječe na njihovu funkciju.

Egzogeni izvori reaktivnih kisikovih molekula

Izlaganje ozonu – Izlaganje ozonu može uzrokovati lipidnu peroksidaciju i izazvati dotok neutrofila u epitel dišnih puteva. Već i kratkotrajna izloženost ozonu uzrokuje oslobađanje upalnih medijatora, kao što su MPO, eozinofilni kationski proteini, laktat dehidrogenaza, albumini.

Dim cigarete – Dim cigarete sadrži velik broj oksidanata i slobodnih radikala uključujući superoksid i dušikov oksid. Osim toga, cigaretni dim u plućima aktivira i neke endogene mehanizme, kao što su nakupljanje neutrofila i makrofaga, što dodatno povećava stvaranje oksidanata.

Hiperoksija – Izlaganje razinama kisika znatno višim od normalnih vrijednosti parcijalnog tlaka kisika dovest će do veće proizvodnje reaktivnih oblika kisika i dušika.

Ionizirajuće zračenje – inducira pojačano stvaranje vodikovog peroksida i organskih hidroperoksida. Ultraljubičaste A zrake (UVA) djeluju preko endogenih fotosenzibilizatora, kao što su porfirini, NADPH oksidaza i riboflavini. UVA-posredovane oksidacije DNA u većini slučajeva se prezentiraju kao reakcije s gvaninom.

Ioni teških metala – kao što su željezo, bakar, kadmij, živa, nikal, olovo i arsen, mogu izazvati stvaranje reaktivnih radikala i uzrokovati oštećenje stanica putem peroksidacije lipida i reakcije s nuklearnim proteinima i DNA. Osim direktnih reakcija oslobađanja slobodnih radikala, neki metalni ioni ulaze u interakcije sa staničnim molekulama i potiču stanične strukture na indirektno stvaranje slobodnih radikala. Posebno izraženu oksidacijsku aktivnost ima arsen koji proizvodi čitav niz reaktivnih kisikovih molekula, uključujući superoksidni anion, singletni kisik, peroksil radikal, dušikov oksid, vodikov peroksid i dimetilarsin peroksil radikale. Uz to spojevi arsena inhibiraju antioksidacijske enzime, osobito enzime ovisne o glutationu, vezivanjem na njihove sulfhidrilne skupine i na taj način dodatno pojačavaju svoj toksičnost.

Paralelno s evolucijskom prilagodbom atmosferi bogatoj kisikom te ulozi mitohondrija i oksidativnog metabolizma, eukariotske stanice su razvile zaštitne sustave koji kontroliraju stvaranje slobodnih radikala i na taj način se suprotstavljaju potencijalnoj opasnosti od oksidativnog stresa. Zaštitni sustavi svoj učinak baziraju na spojevima koji služe kao protuteža učinku oksidanata i nose zajednički naziv antioksidansi. Sukladno svojoj ulozi mehanizmi djelovanja antioksidansa uključuje hvatanje reaktivnih kisikovih spojeva, minimiziranje reaktivnosti kisikovih spojeva, popravljanje ili zamjenu oštećenih ciljnih molekula. Iz praktičkih razloga ovaj sustav antioksidacijske zaštite u stanici se može podijeliti u 2 kategorije: (1) antioksidacijske enzime i (2) antioksidacijske molekule.

Antioksidacijski enzimi

Najvažniji antioksidacijski enzimi u organizmu su superoksid dismutaza (SOD), katalaza i glutation peroksidaza (GSH-Px).

Superoksid dismutaza (SOD) je iznimno važan intracelularni antioksidacijski enzim koji sakuplja superoksidne radikale u stanici i katalizira reakciju dva superoksidna radikala i dva protona proizvodeći vodikov peroksid (H₂O₂) i molekularni kisik (O₂). Međutim, i vodikov peroksid posjeduje visok reaktivni oksidacijski potencijal pa će njegovo prekomjerno nakupljanje i dalje biti štetno. Zbog toga, sav suvišni vodikov peroksid mora odmah biti detoksificiran, a za to su odgovorni enzimi katalaza i glutation peroksidaza.

Katalaza je unutarstanični, visoko aktivni enzim koji se uglavnom nalazi u peroksizomima i koji hvata reaktivne molekule vodikovog peroksida i katalizira njihovu pretvorbu u vodu i molekularni kisik.

Glutation-peroksidaza također smanjuje količinu H₂0₂, ali isto tako uklanja i lipidne hidroperokside (nastale kao posljedica peroksidacije lipidnih membrana). Glutation peroksidaza obuhvaća obitelj tetramernih enzima koji sadrže jedinstvenu selenocisteinsku aminokiselinu i za redukciju H₂0₂ i lipidnih peroksida u njihove odgovarajuće alkohole koriste tiole niske molekulske mase.

Zajednički svim ovim antioksidansima je NADPH kao redukcijski ekvivalent. NADPH direktno održava katalazu u aktivnom obliku te sudjeluje kao kofaktor u glutation reduktazi koja pretvara oksidirani glutation u aktivni oblik (GSSG à GSH). Pritom je važno istaknuti kako unutarstanični NADPH nastaje redukcijom NADP uz pomoć glukoza-6-fosfat dehidrogenaze (G6PD). Sukladno tome, glukoza-6-fosfat dehidrogenaza je kritična odrednica citosolnog glutationskog puferirajućeg kapaciteta (GSH/GSSG) i može se smatrati esencijalnim, regulatornim antioksidacijskim enzimom.

Od ostalih antioksidacijskih enzima još bi svakako trebalo izdvojiti glutation S-transferazu (GST) – velika obitelj izuzetno važnih enzima koji inaktiviraju sekundarne metabolite, kao što su nezasićeni aldehidi, epoksidi i hidroperoksidi. Opisane su tri glavne obitelji GST-a: citosolni GST, mitohondrijski GST i membranski povezani mikrosomalni GST koji ima ulogu u metabolizmu eikosanoida i glutationa.

Antioksidacijske molekule

Antioksidacijske molekule stanice uključuju endogene spojeve male molekularne težine kao što su glutation, mokraćna kiselina, ubikinon (koenzim Q), lipoična kiselina i bilirubin. Antioksidacijske molekule unosimo i hranom i među njima su najvažnije askorbinska kiselina (vitamin C), tokoferoli i tokotrienoli u koje ubrajamo α-tokoferol (vitamin E), karotenoide i flavonoide.

Glutation (GSH, γ-glutamilcisteinil-glicin) je najvažnija antioksidativna molekula stanice koja se nalazi u stanicama sisavaca u koncentracijama do 12 mM od čega mitohondriji sadrže oko 10% do 15% ukupnog glutationa u stanici. Spektar antioksidacijskih učinaka GSH u stanici je vrlo širok i s jedne strane GSH reagira s radikalima izravno u neenzimatskim reakcijama, dok s druge strane djeluje kao kofaktor u brojnim redukcijskim enzimima. Osim toga, GSH štiti stanicu od apoptoze putem interakcije s pro- i anti-apoptotičkim signalnim putevima te sudjeluje u regulaciji aktivacije nekoliko transkripcijskih čimbenika. Odnos aktivnog i oksidiranog glutationa (GSH/GSSG) predstavlja glavnu odrednicu oksidativnog stresa.

Vitamin C (askorbinska kiselina) – je topiv u vodi i osigurava intracelularni i ekstracelularni antioksidativni kapacitet vodene faze prvenstveno uklanjanjem slobodnih radikala kisika. Također onvertira slobodne radikale vitamina E natrag u vitamin E. Pokazalo se da njegova razina u plazmi opada s godinama.

Vitamin E (α-tokoferol) – je topiv u lipidima i koncentriran je u hidrofobnom, unutarnjem sloju stanične membrane gdje predstavlja glavnu obranu od staničnih oštećenja uzrokovanih oksidansom. Vitamin E donira elektron peroksilnom radikalu koji nastaje tijekom peroksidacije lipida te ujedno i inhibira formacije slobodnih radikala. Smatra se također da sudjeluje u aktivaciji apoptoze oštećenih stanica.

Karotenoidi (β-karoten) – su pigmenti koji se nalaze u biljkama. Utvrđeno je da β-karoten reagira s peroksilnim, hidroksilnim i superoksidnim radikalima. Karotenoidi pokazuju svoje antioksidacijske učinke kod niskog parcijalnog tlaka kisika, ali mogu imati prooksidacijske učinke.

Abnormalna razina reaktivnih kisikovih molekula u stanicama, odnosno oksidativni stres, s jedne strane može nastati kao posljedica povećane proizvodnje kisikovih radikala, uslijed oštećene funkcije mitohondrija ili uslijed izmijenjenih metaboličkih zahtjeva organizma ili pak kombinacijom ova dva čimbenika, dok s druge strane, preplavljivanju kisikovih radikala može pogodovati i nefunkcionalnost antioksidacijskog sustava stanične zaštite praćena apsolutnim ili relativnim manjkom antioksidansa.

Kao što je već istaknuto, oksidativni stres pogubno utječe na većinu staničnih struktura, uključujući membrane, lipide, proteine, lipoproteine i nukleinske kiseline. Višak hidroksilnog radikala i peroksinitrita uzrokovat će peroksidaciju lipida, s posljedičnim oštećenjima stanične membrane i lipoproteina. Jedan od glavnih proizvoda oksidativne razgradnje lipida je malondialdehid (MDA), ujedno važan biokemijski biljeg oksidativnog stresa. Aldehidi i konjugiranih dienski spojevi nastali peroksidacijom lipida pokazuju citotoksična svojstva, mutageni su, napadaju proteine ​​i induciraju oksidacijska stanja.

Proteini se djelovanjem kisikovih radikala podvrgavaju različitim konformacijskim modifikacijama koje mogu imati utjecaja na gubitak ili oštećenje njihove enzimske aktivnosti. Proteinski karbonili koji nastaju u ovim reakcijama važan su marker oksidacije proteina. Eliminacija ovih modificiranih proteina odvija se putem proteozomalnih i lizosomalnih degradacijskih procesa.

Oksidacija nukleinskih kiselina je mutagena i može dovesti do različitih modifikacije DNA, kao što su degradacija baza, prekidi jednostruke ili dvostruke DNA, purinske, pirimidinske ili na šećer vezane modifikacije, mutacije, delecije ili translokacije, te umrežavanja s proteinima. Većina tih DNA modifikacija su direktno povezane sa karcinogenezom, starenjem te s neurodegenerativnim , kardiovaskularnim i autoimunim bolestima. Stvaranje 8-hidroksi-gvanina najčešće je oštećenje DNA koje nastaje oksidativnim stresom i važan je biomarker u procjeni oksidativnog oštećenja DNA.

Sve te modifikacije dovode do oštećenja staničnih procesa, a u slučaju jačih oštećenja i do stanične smrti. Živčane stanice su posebno osjetljive na oksidativni stres i to iz nekoliko razloga. Prije svega živčane stanice se ne dijele pa akumuliraju oksidacijska oštećenja tijekom cijelog života. Osim toga živčane stanice su visoko specijalizirane i relativno velike pa zahtijevaju i veću metaboličku aktivnost kako bi osigurale dovoljnu količinu energije potrebnu za svoje funkcije. A veća mitohondrijska aktivnost povezana je s povećanim stvaranjem kisikovih radikala. Stoga nije čudno što se oksidativni stres najčešće povezuje upravo s neurološkim bolestima kao što su Parkinsonova bolest, Alzheimerova bolest, amiotrofna lateralna skleroza (ALS), multipla skleroza, depresija, gubitak pamćenja. Eksperimentalna i klinička istraživanja su pokazala da oksidacijska oštećenja igraju ključnu ulogu u gubitku i progresiji oštećenja neurona u demenciji. β-amiloid, toksični peptid koji se gotovo uvijek nalazi u mozgu bolesnika s Alzheimerovom bolesti, proizvodi se djelovanjem slobodnih radikala i poznato je da je barem djelomično odgovoran za neurodegeneraciju opaženu tijekom početka i progresije Alzheimerove bolesti. Brojne studije su također pokazale kako oksidativni stres igra glavnu ulogu u patologiji amiotrofne lateralne skleroze (ALS). Bolesnici koji pate od različitih oblika ALS-a pokazuju tragove oksidacijskih oštećenja proteina. Mjerenja razina 8-hidroksi gvanina pokazala su da se oksidativno oštećenje DNA nalazi u prednjem rogu cervikalnog dijela leđne moždine ALS bolesnika.

Oksidacijsko oštećenje DNA je također i jedan od važnijih čimbenika odgovornih za razvoj malignoma. Nekontrolirani rast stanica može biti potaknut kromosomskim abnormalnostima ili aktivacijom onkogena uzrokovanih oksidativnim stresom. Konačno, oksidativni stres igra važnu ulogu i u patogenezi čitavog niza drugih oboljenja, posebice onih povezanih sa starenjem organizma kao što su ateroskleroza i koronarna bolest, astma, KOPB, reumatoidni artritis, seksualna disfunkcjia itd.

Laboratorijske markere osidativnog stresa možemo podijeliti u tri glavne kategorije:

1. Reaktivne kisikove molekule
2. Produkti oksidativnog oštećenja (DNA/RNA, lipidi i proteini)
3. Antioksidansi

1. Reaktivne kisikove molekule

Reaktivne kisikove molekule su medijatori oksidativnog stresa koji direktno oštećuju stanične strukture. U organizmu su fiziološki najznačajniji superoksidni anion (O₂^–), hidroksilni radikal (·OH) i vodikov peroksid (H₂O₂). S obzirom na svoju specifičnu strukturu relativno se lako određuju u živim stanicama. Međutim, klinički značaj mjerenja njihove koncentracije u stanicama je malen, s obzirom da izmjerena vrijednost ne odražava objektivni stupanj oksidacije već samo ukazuje na postojanje oksidacijskog potencijala stanica. Stoga je mjerenje reaktivnih kisikovih molekula važno u nekim stanjima i bolestima, najčešće nasljednim, kod kojih postoji sumnja na smanjenu oksidacijsku sposobnost stanica.

2. Produkti oksidativnog oštećenja

Puno precizniji uvid u stupanj oksidativnog stresa dobije se mjerenjem razine oštećenja DNA/RNA, peroksidacije lipida i oksidacije/nitracije proteina.

• 8-hidroksideoksigvanozin (8-OHdG) – Najčešće korišten marker oštećenja DNA oksidativnim stresom.
• Malondialdehid (MDA) – Najčešće korišten marker oštećenja lipida oksidativnim stresom, a ujedno i jedan od najčešće korištenih markera u procjeni oksidativnog stresa općenito. Nastaje peroksidacijom polinezasićenih masnih kiselina.
• Drugi markeri peroksidacije lipida uključuju 4-HNA, 8-izoprostan, lipidne hidroperokside (LPO) i oksidirani LDL.
• Protein karbonil i 3-nitrotirozin – Najčešći su markeri oksidativnog oštećenja proteina.

3. Antioksidansi

Određivanjem koncentracije antioksidansa dobiva se uvid u antioksidativni kapacitet i sposobnost organizma da se bori protiv oksidativnog stresa. Ukupni antioksidativni kapacitet uzorka najčešće se određuje mjerenjem sposobnosti antioksidanata da inaktiviraju reaktivne kisikove molekule. Međutim, da bi se dobio precizniji uvid u stanje antioksidativnog sustava često je neophodno odrediti koncentracije pojedinačnih antioksidativnih markera, npr:

• Glutation (GSH)
• Omjer aktivnog i oksidiranog glutationa (GSH/GSSG)
• Glutation-S-transferaza (GST)
• Glutathion peroksidaza
• Superoksid dismutaza
• Katalaza
• Tiol
• Askorbinska kiselina

Slobodni kisikovi radikali se normalno stvaraju tijekom staničnog metabolizma aerobnih organizama u kojem i sami imaju važnu funkciju. U normalnim uvjetima organizam je uspostavio vrlo učinkovite regulacijske mehanizme za preciznu kontrolu njihovog stvaranja, aktivnosti i inaktivacije. Međutim, ukoliko iz bilo kojeg razloga dođe do značajnijeg narušavanja ove homeostaze, a najčešći uzrok su različiti metabolički poremećaji, stvaranje slobodnih radikala može izmaći kontroli i razvija se stanje koje nazivamo oksidativni stres, s brojnim štetnim učincima po organizam.

Antioksidansi se čine kao najprikladnije rješenje u ublažavanju štetnih učinaka oksidativnog stresa pa su privukli veliku pozornost znanstvenika, ali i šire javnosti, s obzirom na proširenu percepciju da se radi o praktički neškodljivim spojevima s teoretski velikim potencijalom rješavanja ključnih medicinskih problema kao što su maligne, neurodegenerativne, kardiovaskularne i brojne druge kronične bolesti. Širenju takve percepcije svakako doprinosi njihova primjena u kozmetici s pretpostavkom usporavanja starenja stanica kože.

Nažalost, kako u organizmu ništa nije crno-bijelo tako nije ni pitanje terapije antioksidansima. Naime, adekvatan unos antioksidansa ili njihovih prekursora je apsolutno neophodan i umjerena suplementacija antioksidansima svakako opravdana ukoliko je laboratorijskim pretragama utvrđen njihov nedostatak ili evidentni znakovi oksidacijskog stresa.

Međutim, preplavljivanje organizma pretjeranim količinama antioksidansa neće polučiti nikakvu dodatnu korist, dapače u pretjeranoj količini antioksidansi mogu biti samo štetni, zbog interferencije s različitim fiziološkim prooksidacijskim procesima važnim za očuvanja zdravlja, poput sprječavanja razvoja malignih stanica, borbe protiv bakterija i brojnih drugih.